Die Foci-Zählung wird oft als Einkanalproblem behandelt. Ein Marker, eine Bedingung, eine Zählung pro Zelle. Damit ist ein Teil der Frage beantwortet.

Die Biologie umfasst jedoch fast immer mehr als einen Marker. Bei DNA-Schäden treffen γH2AX und 53BP1 am selben Ort zusammen. Replikationsstress verändert das Verhältnis von lizenzierten zu aktiven Origins. Die Kolokalisation zweier Foci markiert ein spezifisches molekulares Ereignis, das keiner der beiden Marker allein erfasst.

Das Problem potenziert sich schnell. Foci pro Zelle in Kanal eins zählen, in Kanal zwei zählen und dann bestimmen, welche Foci aus beiden Kanälen überlappen, pro Zelle, über Tausende von Zellen und mehrere Bedingungen hinweg. Die meisten Pipelines bewältigen einen Kanal und nähern den Rest an.

In Cytely wird jeder Kanal unabhängig segmentiert, und Foci werden als einzelne Objekte detektiert. Die Assoziation wird anschließend pro Zelle über so viele Marker berechnet, wie das Experiment erfordert: Einzelzählungen pro Kanal sowie jede Kombination kolokalisierender Foci. Der Vergleich dieser Werte zwischen Bedingungen wird zu einer gewöhnlichen Gating-Aufgabe.

So läuft der Assay ab

Zellen segmentieren → Foci in Ch2 und Ch3 unabhängig detektieren → jeden Typ pro Zelle zählen und Verhältnisse berechnen. Um zu bestimmen, welche einzelnen Foci von Marker A positiv für Marker B sind: Spots in Ch2 detektieren und Ch3-Intensität in diesen Spots messen.

Was Sie bereitstellen

  • Ch1: DAPI
  • Ch2: Foci-Marker A
  • Ch3: Foci-Marker B

Was Sie erhalten

  • Foci-Anzahl pro Kanal und Zelle
  • Zählverhältnis von Marker A zu Marker B pro Zelle
  • % Zellen, die für beide Marker positiv sind

Einsatzbereit

Telomer-assoziierte DNA-Schadensfoci (γH2AX + Telomer-FISH), Autophagosom-Mitochondrien-Assoziation (LC3 + TOM20 für Mitophagie), Doppelsonden-FISH-Ko-Expression (% Zellen, die Gen A und Gen B exprimieren), PLA + Zelltypmarker, jeder Zweikanal-Puncta-Vergleich.

Für Unterstützung anfragen

Räumliche Distanzmessung pro Spot zwischen zwei Spot-Sätzen, 3D-Spot-Assoziation.

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