Identifizierung von Verunreinigungen in Neutrophilen-Präparationen

Link zum Datensatz

Die Analyse von Zellpopulationen im Vollblut ist eine grundlegende, aber anspruchsvolle Aufgabe. Selbst nach standardmäßigen Aufbereitungsschritten enthalten Proben oft gemischte Populationen aus Leukozyten, Thrombozyten und roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Cytely ermöglicht es Forschenden, diese Populationen schnell auf Einzelzellebene zu identifizieren und zu quantifizieren. Mithilfe von Streudiagrammen und intuitivem Gating lassen sich verschiedene Blutzelltypen in einem unverzerrten, interaktiven Workflow unterscheiden und charakterisieren.

In dieser Note vorgestellte Kernfunktionen:

  • Visualisierung der Heterogenität in einer gemischten Zellpopulation
  • Identifizierung von Populationen (Neutrophile, Thrombozyten, Erythrozyten) mithilfe von Streudiagrammen
  • Gating zur Isolierung von Neutrophilen-Subpopulationen

Von der Blutentnahme und Neutrophilenisolierung über die Fluoreszenzmarkierung und die Bildaufnahme mit motorisierter Mikroskopie bis hin zur automatisierten Segmentierung und interaktiven Gating-Analyse in Cytely und der abschließenden Quantifizierung aufgereinigter Populationen
Abbildung 1: Von der Blutentnahme und Neutrophilenisolierung über die Fluoreszenzmarkierung und die Bildaufnahme mit motorisierter Mikroskopie bis hin zur automatisierten Segmentierung und interaktiven Gating-Analyse in Cytely und der abschließenden Quantifizierung aufgereinigter Populationen

Experimentelle Methode

Blutentnahme und Neutrophilenisolierung

Peripheres Blut wurde von einem gesunden Freiwilligen durch Venenpunktion mit einer Butterfly-Kanüle gewonnen und in Natriumcitrat-Antikoagulationsröhrchen aufgefangen. Die Neutrophilen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque (GE Healthcare) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert.

Zellhandhabung und Färbung

Die isolierten Neutrophilen wurden in Hepes-gepufferter Kochsalzlösung (HBS) (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7,4) resuspendiert und bis zur Verwendung auf Eis gehalten.

Zur Fluoreszenzmarkierung wurden die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert mit:

  • CellMask™ Green Plasma Membrane Stain (2 µM, Thermo Fisher Scientific)
  • CellTracker™ Deep Red (1 µM, Thermo Fisher Scientific)
  • Hoechst-33342-Kernfärbung (5 µg/mL)

Objektträgervorbereitung

Die Vollblutzellen wurden in PBS resuspendiert und für die Bildgebung und anschließende Analyse in Cytely in Ibidi-8-Well-Kammerobjektträger (Ibidi GmbH) ausgesät.

Datenanalyse in Cytely

Der Datensatz wurde über die Drag-and-drop-Oberfläche von Cytely analysiert.

  1. Upload: Die Bilder wurden direkt über die Weboberfläche von Cytely hochgeladen.
  2. Segmentierung: Automatisierte Detektion von Zellkernen und Zytoplasma.
  3. Merkmalsextraktion: Morphologische und Intensitätsparameter (Größe, Form, Kanalintensitäten) wurden pro Zelle berechnet.
  4. Streudiagramme: Die Darstellung von Forward-Scatter-Proxys (Größe, Morphologie) gegen Intensitätswerte trennte die Hauptpopulationen (Abbildung 1).
  5. Gating: Neutrophile, Erythrozyten und Thrombozyten wurden anhand ihrer Streueigenschaften identifiziert (Abbildung 1).
    1. Neutrophile: größere, mehrfach gelappte Zellkerne, starkes Zytosolsignal
    2. Thrombozyten: sehr klein, schwaches Membran- und Kernsignal
    3. Erythrozyten: kernlos, starkes Membransignal, wenig/kein Hoechst
  6. Statistik: Die Neutrophilen wurden isoliert und relevante Parameter der Population extrahiert (Abbildung 2).
Abbildung 2: Interaktive Analyseoberfläche von Cytely. Die Echtzeit-Visualisierung von Streudiagrammen mit Gating-Steuerung ermöglicht die präzise Identifizierung und Quantifizierung von Populationen.
Abbildung 2: Interaktive Analyseoberfläche von Cytely. Die Echtzeit-Visualisierung von Streudiagrammen mit Gating-Steuerung ermöglicht die präzise Identifizierung und Quantifizierung von Populationen.

Ergebnisse und Diskussion

  • Identifizierung von Verunreinigungen: Erythrozyten und Thrombozyten wurden klar von den Neutrophilen getrennt (Abbildung 1).
  • Ergebnis der Aufreinigung: Einfache sequenzielle Gates schlossen Verunreinigungen aus und lieferten einen sauberen Neutrophilen-Datensatz (Abbildung 2).
  • Praktischer Nutzen: Cytely ermöglicht die Echtzeit-Bewertung der Reinheit und die Quantifizierung von Verunreinigungen ohne zusätzliche Assays.
Aufgereinigte Neutrophilen-Subpopulation nach Ausschluss von Verunreinigungen
Abbildung 3. Cytely trennt Blutzellpopulationen mit hoher Präzision. Thrombozyten (A, n=123, 11 % der Zellen) wurden anhand schwacher zytosolischer und membranständiger Fluoreszenz identifiziert. Erythrozyten (B, n=130, 12 %) zeigten ein starkes Membran-, aber kein Kernsignal. Neutrophile (C, n=655, 57 %) wiesen charakteristisch hohe zytosolische und membranständige Intensitäten auf. Diese Kombination aus Streudiagrammen und repräsentativen Bildern bestätigt die Identifizierung aller drei Hauptzelltypen.

Fazit

Cytely verändert die Blutzellanalyse durch eine schnelle, intuitive und eindeutige Bewertung unterschiedlicher Zellpopulationen. Die leistungsstarke Kombination aus automatisierter Segmentierung und streudiagrammbasiertem Gating quantifiziert nicht nur Verunreinigungsanteile präzise, sondern liefert auch eine sofortige visuelle Bestätigung aufgereinigter Subpopulationen – alles in einem einzigen, schlanken Workflow. Mit Cytely wird, was normalerweise mehrere nachgelagerte Assays erfordert, auf einen mühelosen Schritt reduziert, mit reproduzierbaren, publikationsreifen Daten von unübertroffener Klarheit und Zuverlässigkeit.