フォーサイのカウントは、単一チャネルの問題として扱われがちです。1つのマーカー、1つの条件、細胞ごとのカウント。それは問いの一部にしか答えていません。解析の実際の様子はこちら：https://youtube.com/watch?v=isTnJ2ngjQA
フォーサイのカウントは、単一チャネルの問題として扱われがちです。1つのマーカー、1つの条件、細胞ごとのカウント。それは問いの一部にしか答えていません。
生物学的な現象は、ほとんどの場合、複数のマーカーを伴います。DNA損傷では、γH2AXと53BP1が同じ部位に集まります。複製ストレスは、ライセンス化された複製起点と活性化された複製起点の比率を変化させます。2つのフォーサイの共局在は、いずれのマーカー単独では捉えられない特定の分子イベントを示します。
問題はたちまち複雑になります。チャネル1で細胞ごとのフォーサイをカウントし、チャネル2でもカウントし、次に各チャネルのどのフォーサイが重なり合うかを、細胞ごとに、数千個の細胞にわたって、複数の条件にわたって判定します。ほとんどのパイプラインは1つのチャネルを処理し、残りは近似で済ませます。
Cytelyでは、各チャネルが独立してセグメンテーションされ、フォーサイが個々のオブジェクトとして検出されます。その後、実験が必要とする数だけのマーカーにわたって、細胞ごとに関連付けが計算されます。チャネルごとの個別のカウントに加え、共局在するフォーサイのあらゆる組み合わせが得られます。これらの値を条件間で比較することは、標準的なゲーティング作業になります。
アッセイの実行方法
細胞をセグメンテーション → Ch2とCh3でフォーサイを独立して検出 → 各種類を細胞ごとにカウントし比率を計算。マーカーAの個々のフォーサイのうちマーカーB陽性のものを判定するには：Ch2でスポットを検出し、それらのスポット内のCh3強度を測定します。
ご用意いただくもの
- Ch1：DAPI
- Ch2：フォーサイマーカーA
- Ch3：フォーサイマーカーB
得られるもの
- チャネルごと・細胞ごとのフォーサイ数
- 細胞ごとのマーカーAとマーカーBのカウント比率
- 両マーカー陽性の細胞の割合
すぐに実行可能
テロメア関連DNA損傷フォーサイ（γH2AX + テロメアFISH）、オートファゴソーム-ミトコンドリア関連（マイトファジーにおけるLC3 + TOM20）、二重プローブFISH共発現（遺伝子Aと遺伝子Bを発現する細胞の割合）、PLA + 細胞型マーカー、任意の2チャネル斑点比較。
サポートについてはお問い合わせください
2つのスポットセット間のスポットごとの空間的距離測定、3Dスポット関連。