Identifier les contaminants dans les préparations de neutrophiles

Lien vers le jeu de données

L'analyse des populations cellulaires dans le sang total est une tâche fondamentale mais délicate. Même après les étapes de préparation standard, les échantillons contiennent souvent des populations mixtes de leucocytes, de plaquettes et de globules rouges (GR). Cytely permet aux chercheurs d'identifier et de quantifier rapidement ces populations à l'échelle de la cellule unique. Grâce aux nuages de points et à un fenêtrage intuitif, les différents types de cellules sanguines peuvent être distingués et caractérisés dans un flux de travail interactif et impartial.

Principales fonctionnalités présentées dans cette note :

  • Visualiser l'hétérogénéité d'une population cellulaire mixte
  • Identifier les populations (neutrophiles, plaquettes, GR) à l'aide de nuages de points
  • Fenêtrer pour isoler des sous-ensembles de neutrophiles

Du prélèvement sanguin et de l'isolement des neutrophiles au marquage fluorescent, à l'acquisition d'images par microscopie motorisée, à la segmentation automatisée et à l'analyse par fenêtrage interactif de Cytely, jusqu'à la quantification finale des populations purifiées
Figure 1 : du prélèvement sanguin et de l'isolement des neutrophiles au marquage fluorescent, à l'acquisition d'images par microscopie motorisée, à la segmentation automatisée et à l'analyse par fenêtrage interactif de Cytely, jusqu'à la quantification finale des populations purifiées

Méthode expérimentale

Prélèvement sanguin et isolement des neutrophiles

Le sang périphérique a été obtenu auprès d'un volontaire sain par ponction veineuse à l'aide d'une aiguille à ailettes et recueilli dans des tubes anticoagulants au citrate de sodium. Les neutrophiles ont été isolés par centrifugation sur gradient de densité à l'aide de Ficoll-Paque (GE Healthcare), conformément aux instructions du fabricant.

Manipulation et marquage des cellules

Les neutrophiles isolés ont été remis en suspension dans une solution saline tamponnée à l'Hepes (HBS) (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl₂ 2 mM, MgCl₂ 1 mM, pH 7,4) et maintenus sur glace jusqu'à utilisation.

Pour le marquage fluorescent, les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à l'obscurité et à température ambiante avec :

  • CellMask™ Green Plasma Membrane Stain (2 µM, Thermo Fisher Scientific)
  • CellTracker™ Deep Red (1 µM, Thermo Fisher Scientific)
  • Colorant nucléaire Hoechst 33342 (5 µg/mL)

Préparation des lames

Les cellules sanguines ont été remises en suspension dans du PBS et ensemencées dans des lames à chambres Ibidi à 8 puits (Ibidi GmbH) pour l'imagerie et l'analyse ultérieure dans Cytely.

Analyse des données dans Cytely

Le jeu de données a été analysé à l'aide de l'interface glisser-déposer de Cytely.

  1. Import: les images ont été importées directement via l'interface web de Cytely.
  2. Segmentation: détection automatisée des noyaux et du cytoplasme.
  3. Extraction des caractéristiques: paramètres morphologiques et d'intensité (taille, forme, intensités par canal) calculés pour chaque cellule.
  4. Nuages de points: la représentation d'indicateurs substituts de diffusion avant (taille, morphologie) en fonction des valeurs d'intensité a permis de séparer les principales populations (figure 1).
  5. Fenêtrage: les neutrophiles, les GR et les plaquettes ont été identifiés d'après leurs caractéristiques de diffusion (figure 1).
    1. Neutrophiles: noyaux plus grands et multilobés, fort signal cytosolique
    2. Plaquettes: très petites, faible signal membranaire et nucléaire
    3. GR: anucléés, fort signal membranaire, peu ou pas de Hoechst
  6. Statistiques : les neutrophiles ont été isolés et les paramètres pertinents de la population ont été extraits (figure 2).
Figure 2 : interface d'analyse interactive de Cytely. La visualisation en temps réel des nuages de points avec les commandes de fenêtrage permet une identification et une quantification précises des populations.
Figure 2 : interface d'analyse interactive de Cytely. La visualisation en temps réel des nuages de points avec les commandes de fenêtrage permet une identification et une quantification précises des populations.

Résultats et discussion

  • Identification des contaminants : les GR et les plaquettes ont été clairement séparés des neutrophiles (figure 1).
  • Résultat de la purification : de simples fenêtres séquentielles ont exclu les contaminants, produisant un jeu de données de neutrophiles propre (figure 2).
  • Impact pratique : Cytely permet d'évaluer la pureté et de quantifier les contaminants en temps réel, sans test supplémentaire.
Sous-ensemble de neutrophiles purifiés après exclusion des contaminants
Figure 3. Cytely sépare les populations de cellules sanguines avec une grande précision. Les plaquettes (A, n=123, 11 % des cellules) ont été identifiées par une faible fluorescence cytosolique et membranaire. Les globules rouges (B, n=130, 12 %) présentaient un fort signal membranaire mais aucun signal nucléaire. Les neutrophiles (C, n=655, 57 %) affichaient des intensités cytosoliques et membranaires élevées caractéristiques. Cette combinaison de nuages de points et d'images représentatives confirme l'identification des trois principaux types cellulaires.

Conclusion

Cytely transforme l'analyse des cellules sanguines en offrant une évaluation rapide, intuitive et sans ambiguïté de populations cellulaires diverses. Sa puissante combinaison de segmentation automatisée et de fenêtrage sur nuages de points permet non seulement de quantifier avec précision les fractions de contaminants, mais aussi de confirmer visuellement et immédiatement les sous-ensembles purifiés, le tout dans un flux de travail unique et simplifié. Avec Cytely, ce qui nécessite habituellement plusieurs tests en aval se réduit à une seule étape sans effort, produisant des données reproductibles, prêtes pour la publication, d'une clarté et d'une fiabilité inégalées.