Identificación de contaminantes en preparaciones de neutrófilos

Enlace al conjunto de datos

Analizar poblaciones celulares en sangre completa es una tarea fundamental pero compleja. Incluso tras los pasos de preparación estándar, las muestras suelen contener poblaciones mixtas de leucocitos, plaquetas y glóbulos rojos (RBC). Cytely permite a los investigadores identificar y cuantificar rápidamente estas poblaciones a nivel de célula individual. Mediante diagramas de dispersión y una selección (gating) intuitiva, es posible distinguir y caracterizar los distintos tipos de células sanguíneas en un flujo de trabajo interactivo e imparcial.

Funciones clave demostradas en esta nota:

  • Visualización de la heterogeneidad en una población celular mixta
  • Identificación de poblaciones (neutrófilos, plaquetas, glóbulos rojos) mediante diagramas de dispersión
  • Selección para aislar subpoblaciones de neutrófilos

Desde la extracción de sangre y el aislamiento de neutrófilos, pasando por el marcaje fluorescente, la adquisición de imágenes con microscopía motorizada y la segmentación automatizada y el análisis de selección interactiva de Cytely, hasta la cuantificación final de las poblaciones purificadas
Figura 1: Desde la extracción de sangre y el aislamiento de neutrófilos, pasando por el marcaje fluorescente, la adquisición de imágenes con microscopía motorizada y la segmentación automatizada y el análisis de selección interactiva de Cytely, hasta la cuantificación final de las poblaciones purificadas

Método experimental

Extracción de sangre y aislamiento de neutrófilos

Se obtuvo sangre periférica de un voluntario sano mediante venopunción con una aguja de mariposa y se recogió en tubos con anticoagulante de citrato de sodio. Los neutrófilos se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque (GE Healthcare), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Manipulación y tinción de las células

Los neutrófilos aislados se resuspendieron en solución salina tamponada con Hepes (HBS) (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl₂ 2 mM, MgCl₂ 1 mM, pH 7,4) y se mantuvieron en hielo hasta su uso.

Para el marcaje fluorescente, las células se incubaron durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente con:

  • CellMask™ Green Plasma Membrane Stain (2 µM, Thermo Fisher Scientific)
  • CellTracker™ Deep Red (1 µM, Thermo Fisher Scientific)
  • Tinción nuclear Hoechst 33342 (5 µg/mL)

Preparación de los portaobjetos

Las células de sangre completa se resuspendieron en PBS y se sembraron en portaobjetos con cámaras Ibidi de 8 pocillos (Ibidi GmbH) para la obtención de imágenes y su posterior análisis en Cytely.

Análisis de datos en Cytely

El conjunto de datos se analizó con la interfaz de arrastrar y soltar de Cytely.

  1. Carga: las imágenes se cargaron directamente a través de la interfaz web de Cytely.
  2. Segmentación: detección automatizada de núcleos y citoplasma.
  3. Extracción de características: parámetros morfológicos y de intensidad (tamaño, forma, intensidades de canal) calculados por célula.
  4. Diagramas de dispersión: la representación de indicadores análogos a la dispersión frontal (tamaño, morfología) frente a los valores de intensidad separó las poblaciones principales (Figura 1).
  5. Selección (gating): los neutrófilos, glóbulos rojos y plaquetas se identificaron en función de sus características de dispersión (Figura 1).
    1. Neutrófilos: núcleos más grandes y multilobulados, señal citosólica intensa
    2. Plaquetas: muy pequeñas, señal de membrana y nuclear débil
    3. Glóbulos rojos: sin núcleo, señal de membrana intensa, poca o ninguna señal de Hoechst
  6. Estadísticas: se aislaron los neutrófilos y se extrajeron los parámetros relevantes de la población (Figura 2).
Figura 2: Interfaz de análisis interactivo de Cytely. La visualización en tiempo real de diagramas de dispersión con controles de selección permite una identificación y cuantificación precisas de las poblaciones.
Figura 2: Interfaz de análisis interactivo de Cytely. La visualización en tiempo real de diagramas de dispersión con controles de selección permite una identificación y cuantificación precisas de las poblaciones.

Resultados y discusión

  • Identificación de contaminantes: los glóbulos rojos y las plaquetas se separaron claramente de los neutrófilos (Figura 1).
  • Resultado de la purificación: unas sencillas selecciones secuenciales excluyeron los contaminantes y dieron lugar a un conjunto de datos limpio de neutrófilos (Figura 2).
  • Impacto práctico: Cytely permite evaluar la pureza y cuantificar los contaminantes en tiempo real sin ensayos adicionales.
Subpoblación de neutrófilos purificada tras la exclusión de contaminantes
Figura 3. Cytely separa las poblaciones de células sanguíneas con gran precisión. Las plaquetas (A, n=123, 11 % de las células) se identificaron por su débil fluorescencia citosólica y de membrana. Los glóbulos rojos (B, n=130, 12 %) mostraron una señal de membrana intensa pero ninguna señal nuclear. Los neutrófilos (C, n=655, 57 %) presentaron las características intensidades citosólicas y de membrana elevadas. Esta combinación de diagramas de dispersión e imágenes representativas confirma la identificación de los tres tipos celulares principales.

Conclusión

Cytely transforma el análisis de células sanguíneas al ofrecer una evaluación rápida, intuitiva e inequívoca de diversas poblaciones celulares. Su potente combinación de segmentación automatizada y selección basada en diagramas de dispersión no solo cuantifica con precisión las fracciones de contaminantes, sino que también proporciona una confirmación visual inmediata de las subpoblaciones purificadas, todo dentro de un único flujo de trabajo optimizado. Con Cytely, lo que normalmente requiere varios ensayos posteriores se reduce a un solo paso sencillo, generando datos reproducibles y listos para publicación con una claridad y confianza incomparables.