호중구 준비물 내 오염물 식별

데이터셋 링크

전혈의 세포 집단 분석은 기본적이면서도 까다로운 작업입니다. 표준 준비 단계를 거친 후에도 시료에는 백혈구, 혈소판, 적혈구(RBC)가 혼재된 경우가 많습니다. Cytely를 사용하면 연구자가 이러한 집단을 단일 세포 수준에서 신속하게 식별하고 정량화할 수 있습니다. 산점도와 직관적인 게이팅을 통해 편향 없는 인터랙티브 워크플로에서 다양한 혈구 유형을 구별하고 특성화할 수 있습니다.

이 노트에서 소개하는 주요 기능:

• 혼합 세포 집단 전반의 이질성 시각화
• 산점도를 이용한 집단(호중구, 혈소판, RBC) 식별
• 게이팅을 통한 호중구 하위 집단 분리

실험 방법

채혈 및 호중구 분리

건강한 자원자로부터 나비 바늘을 이용한 정맥 천자로 말초 혈액을 채취하여 구연산나트륨 항응고제 튜브에 수집했습니다. 호중구는 제조사 지침에 따라 Ficoll-Paque(GE Healthcare)를 이용한 밀도 구배 원심분리로 분리했습니다.

세포 취급 및 염색

분리된 호중구는 Hepes 완충 식염수(HBS) (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4)에 재현탁하고 사용 전까지 얼음 위에서 보관했습니다.

형광 표지를 위해 세포를 다음 시약과 함께 실온 암실에서 30분간 배양했습니다:

• CellMask™ Green Plasma Membrane Stain (2 µM, Thermo Fisher Scientific)
• CellTracker™ Deep Red (1 µM, Thermo Fisher Scientific)
• Hoechst 33342 핵 염색 (5 µg/mL)

슬라이드 준비

전혈 세포를 PBS에 재현탁한 후 이미징 및 Cytely에서의 후속 분석을 위해 Ibidi 8-well 챔버 슬라이드(Ibidi GmbH)에 분주했습니다.

Cytely에서의 데이터 분석

데이터셋은 Cytely의 드래그 앤 드롭 인터페이스를 사용하여 분석했습니다.

1. 업로드: 이미지는 Cytely 웹 인터페이스를 통해 직접 업로드했습니다.
2. 분할: 핵과 세포질을 자동으로 검출했습니다.
3. 특징 추출: 세포별로 형태 및 강도 파라미터(크기, 형태, 채널 강도)를 계산했습니다.
4. 산점도: 전방 산란 대용 지표(크기, 형태)를 강도 값과 대비하여 플롯함으로써 주요 집단을 분리했습니다(그림 1).
5. 게이팅: 산점 특성을 기반으로 호중구, RBC, 혈소판을 식별했습니다(그림 1).
   1. 호중구: 더 크고 여러 엽으로 나뉜 핵, 강한 세포질 신호
   2. 혈소판: 매우 작고, 약한 세포막 및 핵 신호
   3. RBC: 무핵, 강한 세포막 신호, Hoechst 신호가 거의 또는 전혀 없음
6. 통계: 호중구를 분리하고 해당 집단에서 관련 파라미터를 추출했습니다(그림 2).

결과 및 고찰

• 오염물 식별: RBC와 혈소판이 호중구와 명확하게 분리되었습니다(그림 1).
• 정제 결과: 간단한 순차 게이트로 오염물을 제외하여 깨끗한 호중구 데이터셋을 얻었습니다(그림 2).
• 실질적 효과: Cytely를 사용하면 추가 어세이 없이도 순도를 실시간으로 평가하고 오염물을 정량화할 수 있습니다.

결론

Cytely는 다양한 세포 집단을 빠르고 직관적이며 명확하게 평가함으로써 혈구 분석을 혁신합니다. 자동 분할과 산점도 기반 게이팅의 강력한 조합은 오염물 분율을 정밀하게 정량화할 뿐 아니라, 정제된 하위 집단을 즉시 시각적으로 확인할 수 있게 해주며, 이 모든 것이 하나의 간소화된 워크플로 안에서 이루어집니다. Cytely를 사용하면 일반적으로 여러 후속 어세이가 필요한 작업이 손쉬운 한 단계로 줄어들어, 탁월한 명확성과 신뢰도를 갖춘 재현 가능한 출판 수준의 데이터를 얻을 수 있습니다.