トランスフェクション効率について論文を発表する人はいません。それで助成金を獲得する人もいません。しかし、あらゆるCRISPR実験、あらゆる過剰発現研究、あらゆるウイルスベクター産生の実行が… 解析の実際の様子はこちら：https://youtube.com/watch?v=EuR_Mkd1BhI
トランスフェクション効率について論文を発表する人はいません。それで助成金を獲得する人もいません。しかし、あらゆるCRISPR実験、あらゆる過剰発現研究、あらゆるウイルスベクター産生ランが、これに依存しています。30%が必要だったのにトランスフェクションが5%にとどまれば、下流の作業に費やした1週間と、数千ドル分の試薬を無駄にしたことになります。
厄介なのは、確認しなかった不良なトランスフェクションが原因で実験が失敗し、それが数日後になって初めて判明することが多い点です。解決策は驚くほど単純です。プレートを撮影し、陽性細胞を数え、その割合を算出するだけです。とはいえ、「驚くほど単純」であっても、複数のウェルにわたって目視でスコア化すれば時間がかかりますし、共トランスフェクションでダブルポジティブ率が必要な場合はさらに大変です。
Cytelyなら、シングルポジティブとダブルポジティブの割合を数分で得られます。DAPI + レポーターの画像をアップロードし、強度でゲーティングすれば、確かな数値が手に入ります。デュアルプラスミドの場合、Cytelyは両方のチャネルをクロスゲーティングし、両方のコンストラクトを取り込んだ細胞が正確に何個あるかを示します。これは下流の実験にとって本当に重要な数値です。
アッセイの流れ
DAPIから核をセグメンテーション → 細胞ごとにレポーターチャネルの強度を測定 → 強度ゲーティングによりトランスフェクトされた細胞と未トランスフェクトの細胞を分類。共トランスフェクションの場合：各レポーターチャネルでゲーティングし、シングルポジティブおよびマルチポジティブの集団を特定。
ご用意いただくもの
- Ch1: DAPI
- Ch2: プラスミドA由来の蛍光レポーター（例：GFP）
- Ch3以降: 追加のレポーターチャネル（例：mCherry、BFP）
得られる結果
- トランスフェクトされた細胞の割合（%）（シングルポジティブ、ダブルポジティブ、またはマルチポジティブ）
- 細胞ごとのレポーター強度
- 総細胞数
すぐに実行可能
単一プラスミド、複数プラスミドの共トランスフェクション（2つ以上のコンストラクト）、ウイルス形質導入効率、任意の蛍光レポーターコンストラクト。
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一過性発現と安定発現の識別。